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Pour travailler dans des conditions stériles, il est recommandé d'effectuer toutes les étapes d'une hotte à flux laminaire.
1. Matériaux
- Tampon HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1,8 mM CaCl 2)
- Collagénase D solution: la collagénase D: 100 mg / mL (collagénase D> 0,15 U / mg), dans du tampon HEPES
- DNase I solution: 20000 U / mL de DNase I
- Tampon PBS à pH 7,2
- PEB tampon: une solution mère de BSA partie dans 20 parties de solution de rinçage autoMACS
- Tissus: poumon dérivée du 6 / 7 semaines femelle adulte souris BALB / C, gratuit des organes adjacents.
- En option: microbilles CD11c, MACS colonnes MS, séparateur MACS pour l'isolement de cellules dendritiques à partir de poumons de souris des cellules de suspension
2. Dissocier les tissus pulmonaires
- Rincez le tissu dans une boîte de Pétri contenant du PBS pour éliminer les érythrocytes.
- Transfert d'un maximum de 450 mg tissu pulmonaire à un tube gentleMACS C contenant 4,9 ml de tampon HEPES.
- Ajouter 100 uL collagénase solution D à une concentration finale de 2 D. mg / ml de collagénase
- Ajouter 10 uL DNase I solution pour jusqu'à 150 mg de tissu (concentration finale de 40 U / ml DNase I) ou 20 uL DNase I pour 150 à 450 mg tissu pulmonaire (concentration finale de 80, je U / mL de DNase).
- Bien refermer le tube C et l'attacher sur le dissociateur gentleMACS. Ensuite, exécutez le programme "m_lung_01".
- Incuber pendant 30 min à 37 ° C avec rotation automatique ou manuellement tourner toutes les 5 min.
- Retour à l'échantillon de dissociateur gentleMACS et exécutez le programme "m_lung_02".
3. Filtration
- Préparer un tube de 50 ml pour collecter les cellules filtrées en remplaçant le bouchon avec une passoire 70 um maillage cellulaire.
- Une fois le deuxième programme gentleMACS se termine, selon la distribution de matériel d'échantillon dans le tube, vous pouvez le tube à centrifuger brièvement pour ramasser le matériel d'échantillonnage dans le bas du tube.
- Retirer les cellules à travers le septum étanche du tube C en utilisant un embout de pipette adaptée 1000 ul et les appliquer à la crépine de cellule.
- Laver la crépine de cellules avec 5 ml de tampon HEPES à température ambiante.
- Centrifuger les cellules à un culot dans un tube de 50 ml à 300xg pendant 10 min.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans votre volume désiré de tampon PEB.
Partie 4: Résultats du représentant:
Figure 1. Poumon de dissociation avec le dissociateur gentleMACS ™ abouti à 92% de cellules viables. Les cellules mortes ont été fluorescence colorés à l'iodure de propidium (PI) (dot plot droite; dot plot gauche: pas de coloration PI).
Figure 2. Dissociation des tissus pulmonaires de souris en utilisant les résultats dissociateur gentleMACS dans un pourcentage élevé de leucocytes viables et les cellules endothéliales. Les dérivés mono-cellulaire suspensions ont été colorés avec CD45-PE et CD146-FITC ou CD31-FITC et analysées par cytométrie en flux.
Figure 3. Single-cellules en suspension provenant de tissus pulmonaires de souris a été coloré avec CD11c-FITC et anti-mPDCA-1-APC pour détecter la souris CD11c basse moy-PDCA-1 + DC plasmacytoïdes ainsi que les cellules CD11c élevé.
Figure 4. Enrichissement de cellules dendritiques CD11c utilisant des microbilles, un séparateur MiniMACS et deux colonnes MS.